氢气结合药物对糖尿病及并发症（如糖尿病心脏

【背景介绍】

糖尿病会引起多种并发症，在中老年人群中，糖尿病心脏病是糖尿病患者致死的重要原因之一，尤其是在2型糖尿病患者中。

广义的糖尿病心脏病包含冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)，糖尿病心肌病和糖尿病心脏自主神经病变等。糖尿病心脏病与非糖尿病患者相比，常起病比拟早，糖尿病患者伴冠心病常表示为无痛性心肌梗死，梗死面积比拟大，穿壁梗死多，病情多比拟严重，预后比拟差，病死率较高;如冠状动脉造影和临床排除冠状动脉病变，糖尿病患者呈现严重的心律失常、心脏肥大、肺淤血和充血性心力衰竭，尤其是难治性心力衰竭，临床可斟酌糖尿病心肌病。

其中，糖尿病性心肌病(DCM)是比拟有代表性的疾病。由于它只产生于糖尿病的患者，不能够用高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病以及其他心脏病变来解释的心肌疾病这种情形。

它是由于在代谢杂乱、以及微血管病变的基本上会产生普遍的局灶性的心肌坏死，发生的病因和心肌细胞代谢杂乱，心肌细胞的钙转运缺点有必定关系【1】。如果治疗不当，心脏纤维化和肥大会导致心力衰竭甚至死亡【2】。

【发病机制】

细胞焦亡(细胞炎性坏死)是一种在炎症存在下产生的程序性细胞死亡【3】，其特性是细胞连续增大直至细胞膜决裂，从而引创造显的炎症反响。为了应对不同类型的刺激(如高血糖环境)，细胞会产出各种NRL受体，如NLRP3炎性小体。然后激活裂解caspase-1(cl-Caspase-1，一种蛋白水解酶)。 cl-Caspase-1裂解成孔细胞死亡执行因子gasdermin-D(GSDMD)，GSDMD易位至膜形成孔，导致白细胞介素 (IL)-18 和 IL-1β 的释放【3、4】。

细胞焦亡涉及多种血汗管疾病，例如心肌梗死【5、6】、缺血再灌注损伤【7】，和心肌病【8、9】等。所有这些研讨表明，寻找一种针对DCM细胞焦亡的干涉办法，是预防和治疗糖尿病性心肌病的有效道路。

DCM的另一种发病机制是纤维化，以心室重构为重要标记，导致心室壁僵硬和舒张功能障碍，最终诱发心力衰竭。高胰岛素血症和高血糖会刺激DCM中肾素血管紧张素-醛固酮通路的激活，从而导致转化生长因子-β1 (TGF-β1) 的激活【10】。

TGF-β1是一种促纤维化细胞因子，可使Smad磷酸化。因此，TGF-β1/Smad信号通路充任下游效应器，润饰靶基因表达并最终导致心脏纤维化和收缩/舒张功能障碍【11】. TGF-β1已成为抗纤维化治疗最主要的靶点之一【12】，对延缓病情进展，减少心力衰竭的产生具有主要意义。

因此，寻找能够选择性克制细胞焦亡、纤维化的有效干涉办法，对于预防DCM具有主要的临床意义。

【氢气用于DCM治疗的可行性剖析】

氢气通过选择性地减少细胞氧自由基，特殊是最有害的活性氧 (ROS)，起到治疗性抗氧化剂的作用【13】。近年来，氢气已被证明具有抗炎、抗氧化和抗纤维化的特征【14、15】。越来越多的证据表明，氢气对缺血性心脏病有效【16】、小肠和肺的缺血再灌注损伤【17、18】，失血性休克【19】。

二甲双胍作为时下治疗糖尿病的一线药物【20】，已被证明具有降血糖作用和心脏掩护作用【21】。但是，肝肾功能不全限制了它的高剂量使用【22】。氢气吸入具有多种作用机制，无副作用、安全且易于使用【23、24】，因此，氢结合二甲双胍可能是一种新的治疗策略。

【研讨试验】

来自中国哈尔滨医科大学第四从属医院心内科、检验科的团队，进行了这方面的研讨，其结果发表在《Free Radical Biology and Medicine》上面。

试验选用4周龄雄性C57BL/6小鼠，将小鼠随机分为五组：分离为对比组 (n = 10)、糖尿病组(DM，n = 10)、吸入氢气治疗组(DM + H2，n = 10)、二甲双胍治疗组 (DM + Met , n = 10) 和用二甲双胍和氢气治疗组(DM+Met+H2，n=10)。所有小鼠都在尺度条件下被圈养和适应环境，并喂食正常食物直至研讨停止。

然后，为糖尿病组小鼠树立糖尿病模型(血糖值≥16.7 mmol/L 证实糖尿病模型树立胜利)【25,26】。接下来，各组按下列方法进行治疗。吸入氢气治疗组，每天吸入2%氢气3小时;二甲双胍治疗组，在饮用水中参加二甲双胍 (200 mg/kg/d,Sigma)【25、27】;二甲双胍和氢气治疗组，接受氢气和二甲双胍结合治疗。所有小鼠饲养8周，之落后行相干检测。

【试验成果】

试验成果一：氢气改善了糖尿病小鼠的心功能障碍和异常形态构造

研讨团队通过超声心动图用于评估心脏功能的变化。糖尿病组小鼠有显著的心脏收缩和舒张功能障碍，这种转变在氢气指治疗组中大大减少。

这些变化显示在左心室射血分数(EF%)、左心室短轴缩短率(FS%)、舒张末期左心室内径(LVIDd)和收缩末期左心室内径(LVIDs)的数据对照中。

糖尿病组小鼠的心肌表示出严重的肌节杂乱和线粒体(M)肿胀，这在对比组中未见，氢气治疗组的肌节杂乱和线粒体肿胀显著减少。

糖尿病组的脑利钠肽(BNP)浓度明显升高，这种变化在氢气治疗组中被逆转。综上所述，这些数据表明氢气可以减轻心脏功能障碍和异常。

成果二：氢气可降低糖尿病小鼠 NLRP3 介导的细胞焦亡蛋白的表达

为了肯定氢对糖尿病小鼠细胞焦亡的疗效，研讨团队视察了细胞焦亡相干的蛋白质程度。

成果发现，NLRP3、cl-Caspase-1、ASC、IL-18、IL-1β和GSDMD-N程度在糖尿病组小鼠中升高;而氢气吸入治疗，有效地恢复了这些炎症细胞因子程度。

另外，与糖尿病组小鼠比拟，氢气治疗组小鼠NLRP3、cl-Caspase-1和IL-1β程度较低。以上成果阐明氢气可以减少糖尿病小鼠的心脏NLRP3相干细胞焦亡。

成果三：氢气可降低糖尿病小鼠 TGF-β1 介导的纤维化蛋白的表达

过度心肌纤维化是扩张型心肌病的另一个主要特性，给治疗带来艰苦。TGF-β1/Smad信号通路在心肌纤维化过程中起着至关主要的作用【10、11】。为了验证氢气对糖尿病小鼠心肌纤维化的疗效，研讨团队视察了纤维化相干蛋白程度。

与对比组相比，糖尿病组小鼠的TGF-β1、p-smad3、p-smad2、COL-I、COL-III 和 α-SMA 程度明显升高，而这些蛋白程度在经过吸入氢气治疗后明显降低。

免疫组织化学染色测试，也证明了这些发现，表明氢气吸入降低了糖尿病组组中 TGF-β1、COL-I和COL-III的程度。以上成果表明氢气可以减轻糖尿病小鼠的心脏纤维化。

成果四：在高血糖 (HG) 条件下吸入氢气，通过减少AMPK/ mTOR/NLRP3信号通路克制细胞焦亡

在确认氢在减轻糖尿病小鼠细胞焦亡中的作用后，下一步是说明其潜在机制。既往研讨证实，富氢盐水可通过AMPK/mTOR信号通路减少内毒素引起的急性肺损伤【28】，二甲双胍通过 AMPK/mTOR道路减轻【25】糖尿病。推测氢也可能通过介导糖尿病组中的AMPK/mTOR/NLRP3 通路来克制细胞焦亡。

为了更好地懂得氢、AMPK和 NLRP3 之间的相互作用，研讨团队提取了原代心肌细胞，并在用氢干涉高糖环境(标志为HG+H2)和不用氢干涉的高糖环境 (标志为HG) 处置的 5.0 mmol/L(对比)和 30 mmol/L 葡萄糖中生长。Compound C(标志为CC)是一种选择性，ATP 竞争性的 AMPK 克制剂，被证明可加重高葡萄糖诱导的细胞损伤，并充任阻断剂，采取氢干涉高糖环境，添加Compound C (标志为HG+H2+CC) 对高糖处置的心肌细胞进行给药处置。

采取Hoechst33342/PI双荧光染色检测高糖诱导的细胞死亡，成果显示高糖诱导的原代心肌细胞死亡增长被氢气逆转，而这种掩护作用被CC干涉损坏。

通过CCK8测定和LDH释放测定，检测心肌细胞的活性和损伤水平，成果与Hoechst33342/PI 双荧光染色的成果一致，表明CC损坏了氢的掩护作用。

随后，经过Western blot检测，显示HG组的 p-AMPK 程度降低。经过氢气治疗后HG+H2组mTOR、IL-18、IL-1β、cl-Caspase-1、ASC、GSDMD-N和NLRP3的程度明显低于 HG 组;这种掩护作用被 CC 损坏了(HG+H2+CC)。这些发现表明氢通过 AMPK/mTOR/NLRP3轴克制细胞焦亡。

成果五：高糖环境下吸入氢气，通过克制 TGF-β1/Smad 通路减轻纤维化

在确认氢气减轻糖尿病小鼠的心肌纤维化以及氢气降低 TGF-β1、p-smad3 和 p-smad2 的程度后，研讨集团摸索氢气与TGF-β1的关系。

取心脏成纤维细胞，并在用氢干涉高糖环境 (HG + H2) 或不用氢气干涉的高糖环境(HG)， 处置的 5.5 mmol/L(对比)和 30 mmol/L 葡萄糖溶液中造就;将外源性 TGF-β1 于用氢气干涉的高糖环境中(标志为HG + H2+TGF-β1)。

依据蛋白质印迹，TGF-β1、p-smad3、p-smad2、COL-I、COL-III和α-SMA程度在不用氢气干涉的高糖环境中明显更高;经过氢干涉高糖环境(HG + H2)处置后，程度明显降低;在添加了外源性TGF-β1，氢气的掩护作用被损坏。

TGF-β1的免疫荧光检测证实了这一发现

心脏成纤维细胞(CFs)迁移是病理性纤维化的另一个原因。Transwell(用于检测细胞迁移)用于评估氢气对CFs迁移的影响。

成果表明，在不用氢气干涉的高糖环境中(HG)增长了CFs在心底中的迁移，氢气干涉(HG+H2)有效地阻拦了迁移，但这种掩护作用，被外源性TGFβ1损坏。

成果六：二甲双胍+氢气治疗克制糖尿病引起的小鼠组织病理学转变

尽管二甲双胍是一线药物，但由于担忧副作用风险增长，在肝肾功能不全患者中大剂量使用历来是禁忌的【22】。氢气是一种生理惰性气体，不会与任何活性化合物产生反响【29】，非常易于使用。接下来，研讨团队剖析了糖尿病小鼠对二甲双胍和氢气结合给药的反响。

试验人员将小鼠分为5组，对比组 (n = 20)、糖尿病组(DM，n = 20)、吸入氢气治疗组(DM + H2，n = 20)、二甲双胍治疗组 (DM + Met , n = 20) 和用二甲双胍和氢气治疗组(DM+Met+H2，n=20)。2个月后，各组存活数目依次为20、10、14、13、17。

二甲双胍和氢气处置均进步了小鼠的存活率，而二甲双胍和氢气结合给药表示出更明显的掩护作用，另外，单独使用二甲双胍 (DM + Met) 或与氢气结合使用 (DM + Met + H2)可明显降低空腹血糖程度。与DM组相比，DM+H2组空腹血糖程度略有降低。

左心室射血分数(EF%)、左心室短轴缩短率(FS%)增长，舒张末期左心室内径(LVIDd)和收缩末期左心室内径(LVIDs)减少，表明氢气结合二甲双胍治疗，比单一治疗施展更明显的后果。

HE染色(苏木精-伊红染色法)显示糖尿病组心肌构造异常、肥厚，单次服用二甲双胍或氢气可减轻这种心肌构造异常、肥大，而同时结合服用二甲双胍和氢气后果更明显。

Masson染色(固绿法)显示DM+Met+H2组间质纤维化水平低于单一治疗组。此外，透射电子显微镜显示，糖尿病组肌节(肌原纤维节，是肌原纤维的基础单位)杂乱、线粒体肿胀、细胞核固缩;而在DM+Met、DM+H2组中，这种问题得到缓解;在DM+Met+H2组中，肌节杂乱、线粒体肿胀、核固缩等损伤几乎完整打消。

成果七：与单独干涉相比，二甲双胍结合氢气干涉，减少了糖尿病小鼠的细胞焦亡和纤维化

氢气克制糖尿病小鼠模型中的细胞焦亡和纤维化，二甲双胍已被证明具有抗细胞焦亡和抗纤维化特征【25、30】。研讨团队通过蛋白质印迹和免疫组织化学测定蛋白质，评估二甲双胍和氢气结合给药对糖尿病小鼠细胞焦亡相干蛋白和纤维化相干蛋白表达的影响。

二甲双胍和氢均降低了NLRP3、cl-Caspase-1和IL-1β的表达，而结合治疗更明显降低了蛋白质表达程度。

Western blot检测，也发现DM + Met+ H2组的TGF-β1、p-smad3、p-smad2和α-SMA 程度，低于DM+H2和DM+Met组。

此外，免疫组织化学检测，也证实了相似的现象。这些成果表明，与单独给药相比，二甲双胍和氢气的共同给药，对 DCM 显示出更好的抗细胞焦亡和抗纤维化作用。

成果八：在高血糖(HG)环境下，二甲双胍结合氢气干涉，进一步减轻了细胞损伤。

依据cck-8检测(细胞增殖毒性检测)，高血糖会明显降低心肌细胞的活性。

二甲双胍和氢气都增长了暴露于高血糖的心肌细胞的活性，而二甲双胍和氢气的共同给药，提供了更好的掩护作用(图A);LDH释放实验成果也验证了上面的结论(图B)。

蛋白质印迹剖析的成果表明，高血糖上调了细胞焦亡相干蛋白，包含 IL-1β、cl-Caspase-1、ASC 和 NLRP3。

而二甲双胍和氢气的共同给药组的的蛋白表达程度，明显低于单一治疗组。这些数据表明，二甲双胍和氢气的共同给药可以减少高血糖条件下的细胞焦亡，从而最大限度地减少细胞损伤。

成果九：在高血糖环境下，二甲双胍结合氢气干涉，进一步缓解了纤维化。

Western blot检测发现，高血糖环境增长了纤维化相干蛋白TGF-β1、p-smad3、p-smad2、COL-I、COL-III、α- SMA的蛋白表达程度。

而结合治疗比单一治疗，更能减少纤维化相干蛋白的表达。

此外，α-SMA的免疫荧光染色检测，也验证了上面的结论。

Transwell试验(细胞体外侵袭试验)与心脏成纤维细胞(CFs)迁移，表明高血糖增长了CFs迁移才能，而用二甲双胍或氢气处置，减轻了 CFs 迁移才能。值的关注的是这种迁移才能在二甲双胍和氢气结合给药时到达最低水，表明结合治疗的疗效更高。

【成果剖析】

研讨团队指出，这是首次证明吸入氢气可通过克制细胞焦亡和纤维化，有效减轻糖尿病小鼠的心脏损伤。证据表明，氢气通过降低 AMPK/mTOR/NLRP3 信号通路减少细胞焦亡，并通过克制TGF-β1/Smad 信号通路减轻纤维化。

进一步的研讨证实，与单独给药相比，二甲双胍和氢气的共同给药对糖尿病心脏病(DCM)具有更好的掩护作用，表明氢气可以与二甲双胍结合使用以减轻 DCM。这些发现为治疗糖尿病心脏损伤提供了一种候选策略。

由于衰老、肥胖和糖尿病，心力衰竭的发病率及其相干的发病率和死亡率正以惊人的速度增长。众所周知，在心力衰竭方面，糖尿病患者的临床成果比非糖尿病患者更差【2】。糖尿病的并发症，如扩张型心肌病、糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变，对人类的迫害最大。

氢气是继 NO、CO 和 H2S 之后发现的医用气体。它具有普遍的有益特征，包含抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡、抗纤维化、抗过敏和能量代谢刺激特征【14、15】。

氢气改善了糖尿病小鼠的心功能障碍，通过左心室射血分数(EF%)、左心室短轴缩短率(FS%)增长，和脑利钠肽(BNP)浓度的减少来体现。依据HE和Masson染色检测，心肌构造异常、肥大表型和胶原蛋白沉积等症状，通过吸入氢气而减少。这些数据首次证实了氢在DCM中的心脏掩护作用。

氢气结合二甲双胍，在 DCM 中施展心脏掩护作用

越来越多的证据表明细胞焦亡会导致 DCM 的心脏损伤，克制细胞焦亡可以大大改善预后【8、31、32】。在本研讨中，糖尿病小鼠体内细胞焦亡相干蛋白程度(包含 NLRP3、cl-Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18 和 GSDMD-N)明显升高，而在吸入氢气后这些指标明显降低，这与心脏异常形态和心功能障碍的明显改善有关。蛋白质印迹剖析成果显示，氢气增长了p-AMPK 的表达，逆转了细胞焦亡相干蛋白的表达，包含 NLRP3、GSDMD-N、cl-Caspase- 1、ASC、IL-1β 和 IL-18，再次验证了上述试验成果。这些发现表明，氢气通过克制AMPK/mTOR/NLRP3 信号通路来减少细胞焦亡。

心肌纤维化是糖尿病的另一个主要病理特性。纤维化归因于过量的心脏成纤维细胞(CFs)。TGF-β1是心脏纤维化进程的重要执行者，它由CFs发生。研讨发现 TGF-β1/Smad 信号通路在糖尿病小鼠和高血糖环境(HG)处置的 CFs中都被激活，TGF-β1、p-smad3、p-smad2、COL-I、COL-III 的发生增长证明了这一点。氢克制了糖尿病小鼠和高血糖环境(HG)处置的CFs中纤维化相干蛋白的表达，阐明氢气通过克制 TGF-β1/Smad 信号通路来预防纤维化。

综上所述，这些成果表明氢在 DCM 中具有抗焦亡和抗纤维化的特征，这可能为氢如何改善心脏功能障碍和异常形态构造提供解释。

以往的证据表明，氧化应激与细胞焦亡和纤维化亲密相干【33、34】。高血糖引起的过量ROS会损坏线粒体和核DNA，增进DCM的发展【35】。使用抗氧化剂降低糖尿病患者ROS程度，已被证明可以最大限度地减少心肌纤维化并改善心肌收缩功能 【36】。氢气作为一种新型医用气体，首先被发现可以减少ROS的形成【13】。斟酌到其不同的特征，氢也可能通过减轻氧化还原反响参与掩护DCM。

【研讨结论】

虽然二甲双胍在降低糖化血红蛋白方面更有效，但副作用，包含胃肠道问题、药物性皮炎和乳酸性酸中毒，在临床使用相当长一段时光后变得显著。二甲双胍的负面影响，特殊是对患有肝病或肾病的人，限制了它的高剂量使用【22】。为了减少副作用，现在普遍采取基于二甲双胍的结合疗法。

在上面的研讨中，与单次给药相比，二甲双胍和氢气的共同给药进一步降低了糖尿病小鼠的细胞焦亡相干蛋白和纤维化相干蛋白的表达，即使在高血糖环境(HG)下也是如此。氢气与二甲双胍具有类似的作用，这已通过免疫组织化学、免疫荧光和 transwell 测定法得到证实。氢气和二甲双胍都可以减少细胞焦亡和纤维化，它们可以在很大水平上平行的道路上施展作用。

氢气可以与二甲双胍结合使用，在扩张型心肌病中表示出更强的心脏掩护作用。因此，研讨团队建议结合使用二甲双胍和氢气，治疗糖尿病心脏病(DCM)。

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